活性多肽IKVAV纳米纤维凝胶的自组装及其生物相容性检测

生物工程学报 Chin J Biotech 2009, February 25; 25(2): 292-298
journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061
cjb@im.ac.cn © 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved
Received: August 14, 2008; Accepted: November 13, 2008
Supported by: the National Natural Science Foundation of China (No. 30500511).
Corresponding author: Yongchao Wu. E-mail: wuyongchao@hotmail.com
国家自然科学基金项目(No. 30500511)资助。
组织工程与细胞培养
自组装IKVAV 多肽纳米纤维支架凝胶及其对嗅鞘细胞
的作用
徐会法, 邵增务, 吴永超, 邓超, 俞旭东, 丁凡, 张保龙, 徐蔚蔚
华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科, 武汉 430022
摘 要: 旨在观察自组装IKVAV 多肽纳米纤维支架凝胶对鼠嗅鞘细胞(OECs)的作用。通过调整IKVAV 溶液pH 值并加
入培养液触发多肽自组装为支架凝胶, 用原子力显微镜检测IKVAV 分子可以自组装成编织状纳米纤维(直径为3~5 nm)。
采用原代分离培养方法获得OECs 单细胞悬液后, 使用差速贴壁法两次纯化OECs 且在第12 天通过免疫染色计数OECs
纯度为85%。将IKVAV 多肽纳米纤维支架凝胶与OECs 复合培养, 倒置显微镜下观察OECs 生长良好, Calcein-AM/PI
活、死细胞染色表明活细胞数达95%。CCK-8 法间接细胞计数证实IKVAV 多肽可促进OECs 的黏附, 对OECs 增殖没
有影响。由此可见IKVAV 多肽可以自组装成纳米纤维支架凝胶且对OECs 有良好的生物相容性及黏附作用, 可作为神
经组织工程支架材料。
关键词: 纳米纤维, 组织工程, 自组装, 嗅鞘细胞
Effects of self-assembled IKVAV peptide nanofibers on
olfactory ensheathing cells
Huifa Xu, Zengwu Shao, Yongchao Wu, Chao Deng, Xudong Yu, Fan Ding, Baolong Zhang,
and Weiwei Xu
Department of Orthopaedics, Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China
Abstract: We observed the effects of IKVAV self-assembling peptide nanofiber scaffold (SAPNS) on olfactory ensheathing cells
(OECs). The IKVAV molecules were triggered to self- assemble to interconnected nanofibers hydrogel by adjusting pH of solution
and adding of DMEM/F12 culture medium. Atomic Force Microscopy (AFM) showed that self-assembly hydrogel was consisted of
the interconnected nanofibers, which varied from three nm to five nm in diameter and hundreds nanometer in length. The primary
OECs were isolated from rat olfactory bulb and purified by differential adhesion twice. At days 12, the purity of OECs was 85%
according to immunostaining of P75 NGFR antibody. OECs were cultured with IKVAV peptide. The adhesion, viability and
proliferation of OECs were observed with inverted microscope, Calcein-AM /PI staining and Cell Counting Kit-8. OECs cultured on
IKVAV SAPNS grew well and the viable cell count was 95%. IKVAV SAPNS can promote the adhesion of OECs and did no hinder
the proliferation of OECs. IKVAV SAPNS nanofiber gel has good biocompatibility and bioactivity for OECs. It can serve as a good
nerve tissue engineering scaffold.
Keywords: nanofiber, tissue engineering, self-assembly, olfactory ensheathing cells
徐会法等: 自组装IKVAV 多肽纳米纤维支架凝胶及其对嗅鞘细胞的作用 293
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脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)的发病率随着社会的发展而逐年增高, 往往导致大部分肢体瘫痪,
给个人、家庭及社会带来极大痛苦与负担，因此一直是骨科等研究的重点和难点, 上世纪末兴起的神经组织工程被公认为治疗脊髓损伤非常有前景的方法, 这包括3 个主要的内容: 种子细胞、支架材料和各种生长因子提供的内环境。传统支架材料普遍存在机械强度高、生物降解性差、降解物具有毒性、易产生免疫反应及无生物学活性等缺点, 限制了它们在中枢神经组织工程的应用[1], 为此需要寻找一种新的支架材料作为修复载体治疗SCI。多肽自组装纳米纤维材料因为具有良好的生物相容性和生物活性成为生物支架材料发展的一个非常重要的方向。前期实验设计和合成了层粘连蛋白中的活性多肽片段IKVAV(Ile-Lys-Val-Ala-Va1)的自组装纳米纤维材料[2], 并证实其对PC12 细胞和神经干细胞具有良好的生物相容性, 并能促进其粘附和分化[3−7]。嗅鞘细胞(OECs)也是治疗脊髓损伤最有前景细胞之一。本实验为OECs 与IKVAV 多肽纳米纤维支架复合的细胞假体应用于脊髓损伤治疗的可行性提供实验依据。
1 材料和仪器
1 周龄SPF 级SD 大鼠(购于华中科技大学同济医学院实验动物中心), IKVAV 多肽两亲性分子(委托上海波泰生物科技公司合成, 用高效液相色谱仪和质谱仪进行纯化和分析, 相对分子质量为1351.6,纯度为98%), DMEM/F12 培养基, 胎牛血清(Gibco公司), 多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine, PLL), 0.125%胰酶(Sigma 公司), 牛垂体提取液(Bovine pituitaryextract BPE, Invitrogen 公司), Forskolin(福斯高林Sigma 公司)CCK-8 试剂盒(Cell counting kit-8, 上海同仁化学研究所), P75 NGFR 抗体, SABC 试剂盒(博士德公司)宝特 Elx-808 酶标仪(Bio-Tek, Elx-808 型,USA), 倒置显微镜(OLYMPUSCKX41-F32FL), 原子力显微镜(Atomic Force Microscopy, JEM-1230)。2 方法
2.1 IKVAV 活性多肽自组装为纳米纤维支架取10 mg 的IKVAV 两亲性分子加入400 μL 无菌的0.1 mol/L NaOH 和400 μL 双蒸水放置在37oC、30 min, 振荡后溶解成为澄清液体, 逐加入
10 μL 0.1 mol/L HCl 缓慢调整多肽溶液pH 值至8.5,加入无菌双蒸水使使总体积为1 mL, 浓度为1%(W/V), 此时可见多肽溶液呈粘稠液态, 取多肽溶液200 μL, 加入200 μL 含有二价阳离子的DMEM细胞培养基溶液引发自组装[8]。2.2 组织取材及细胞培养纯化并鉴定无菌条件下, 取出10 只7 d 的SPF 级SD 大鼠嗅球, 解剖显微镜下仔细剥除嗅球表面的微血管及软脑膜, 将整个嗅球剪碎至直径0.5 mm 的组织块,加入0.125% 胰蛋白酶37oC 消化15 min, 含10%FBS 的培养液终止消化10 min, 吹打20 次至细胞悬液, 1000 r/min 离心5 min 吸除上清液, 加入培养液(DMEM/F12 培养基, 10% FBS, 牛垂体提取液20 mg/L, Forskolin 20 μmol/L)重悬细胞, 小心将细胞悬液转移至培养瓶中, 于37oC、5% CO2 培养箱中培养20 h 后细胞悬液转移至另一培养瓶中, 重复1次。取一块24 孔板, 在中间8 孔内每孔放入一块经PLL 处理的盖玻片, 在每孔内加入约1 mL 细胞悬液,细胞浓度为1×105 于37oC、5% CO2 培养箱中培养,每3 d 换液, 以观察细胞形态并用P75 NGFR 特异性抗体作免疫组化染色鉴定OECs 细胞[9]。2.3 IKVAV 多肽材料与OECs 的生物相容性检测用浓度为30 mg/L 的多肽溶液包被盖玻片, 放入24 孔板中, 将OECs 细胞调整至5× 105/mL, 接种于多肽包被的盖玻片上。同时接种于浓度为0.1 mg/mL 的多聚赖氨酸包被的盖玻片作为对照,将培养7 d 和12 d 的盖玻片取出, PBS 冲洗3 次, 加入终浓度为4 μmol/L 的 Calcein-AM 和20 μmol/L的PI 进行活死细胞染色, 37oC 孵育30 min 后PBS冲洗3 次, 甘油封片, 激光共聚焦显微镜下观察活、死细胞情况。2.4 IKVAV 多肽对OECs 的毒性和增殖的影响取2 块96 孔板, 将细胞悬液接种于板内, 每板接种60 孔, 每孔100 μL 细胞悬液, 置于37oC、5%CO2 及饱和湿度孵育箱中培养, 2 d 后换液。将其分为6 组, 1 个对照组5 个实验组, 每组10 孔, 前3 孔作空白对照。对照组为A 组加入不含IKVAV 多肽的
培养液(A 组DMEM/F12 培养基+10% FBS+牛垂体提取液20 mg/L+Forskolin 20 µmol/L)。5 个实验组分别为B 组、C 组、D 组、E 组和F 组, 每组加入含不294 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2009 Vol.25 No.2Journals.im.ac.cn同浓度的IKVAV 多肽纳米纤维支架的培养液(DMEM/ F12 培养基+10% FBS+牛垂体提取液20 mg/L+Forskolin 20 μmol/L+IKVAV), 其浓度分别为320、160、80、40 和20 mg/L。分别于3 d 和7 d 取出1 块96 孔板, 加入细胞毒性/增殖检测试剂CCK-810 μL, 避光放入37.0oC 培养箱中培养4 h, 取出用
酶标仪测吸光度值, 激发光波长为450 nm。2.5 IKVAV 多肽对OECs 的粘附率的影响取4 块96 孔板, 分为1 个对照组(A 组)和5 个实验组(B、C、D、E 和F 组), 分别用无菌双蒸水配制浓度为0、10、20、40、80、160 mg/L 的IKVAV两亲性分子, 分别加入到4 个预先用PLL 包被的96孔板中, 每孔加入30 μL 不同浓度的IKVAV 溶液。将96 孔板放入37.0oC 温箱中包被过夜, 然后放入超净工作台中吹干。96 孔细胞培养板的每一个孔的底面积为0.32 cm2, 所以A 至F 组的培养板中IKVAV 的密度分别为0、0.99、1.88、3.76、7.52、15.0 μg/ cm2 用磷酸盐缓冲液洗96 孔板3 次, 每次5 min。用培养液调整细胞浓度为6×108/L, 加入到上述用不同浓度的IKVAV 包被的4 个96 孔细胞培养板, 每孔加入细胞悬液100 μL, 含有6×104 个细胞。为了计算细胞黏附率并对比8 h、13 h、18 h 和23 h的细胞黏附, 设标准组1 个(G 组), 在上述4 个培养板分别取6 孔, 加入含有6×104 个OECs 细胞的细胞悬液100 μL, 标准组含有100%的细胞数。将4 个上述加入OECs 细胞的培养板放入37oC、5% CO2 饱和湿度的培养箱中, 分别培养8、13、18 和23 h。 8 h时各实验组和标准组称为A8、B8、C8、D8、E8、F8 和G8, 13 h 时各实验组和标准组称为A13、B13、C13、D13、E13、F13 和G13, 以此类推。除了标准组(G8、G13、G18 和G23 组)外, 吸出各组中的细胞培养基, 每孔用磷酸盐缓冲液均匀冲洗孔壁, 然后
吸出磷酸盐缓冲液。重复磷酸盐缓冲液冲洗2 次。OECs 细胞黏附检测: 本实验通过细胞活性检测试剂CCK-8 间接检测细胞数量, 并计算细胞黏附率。在上述培养液中加入细胞活性检测试剂CCK-8 溶液,比例为10:1。除了标准组外, 每孔中加入上述培养液/CCK-8 溶液110 μL, 标准组中每孔直接加入纯CCK-8 溶液10 μL, 避光放入37oC 培养箱中培养4 h取出用酶标仪读取吸光度值, 激发光波长为450 nm,将各实验组的平均值和标准组的平均值相除, 得到各实验组的细胞黏附率。2.6 统计学处理全部数据用均数±标准差表示, 采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析, 两组数据比较采用两独立样本t 检验, P<0.05 表示有显著性差异。3 结果
3.1 自组装凝胶的鉴定原子力显微镜观察显示含IKVAV 活性部位的多肽溶液在DMEM 触发下自组装为凝胶, 凝胶为编织状纳米纤维, 纤维直径为3~5 nm, 长度为数百纳米, 纳米纤维之间可交织形成网状结构, 纤维间有较大空隙(图1)。
图1 IKVAV 自组装后原子力显微镜检测IKVAV 纳米纤维
Fig. 1 Atomic Force Microscopy (AFM) testing of nanofibers.
AFM showed that self-assembly hydrogel was consisted of the
interconnected nanofibers, which varied from 3 nm to 5 nm in
diameter and hundreds nanometer in length. Scale bar=0.2 μm.
3.2 OECs 的形态观察及免疫染色鉴定种植24 h 后可见大量细胞存活, 突起短, 胞体大, 散在生长。第3 天(图2), 细胞立体感强、透亮,突起细长轮廓清晰、立体感强, 其中以对称突起的双极细胞为主, 其胞体呈长梭形, 细胞核位于中央亦呈梭形, 三极细胞有3 个突起, 胞体呈三角形, 细胞核位于中央亦呈梭形, 两者共同的明显特点是突起细长。7 d 时(图3)OECs 细胞密度增加, 胞体较亮,其突起为双极或三极, 突起变长; 背底有成纤维细胞存在, 胞体较大、扁平, 其立体感、折光性较差,至l2 d, 细胞更加密集, 细胞胞体突起呈现平行排列,P75 NGFR 免疫细胞化学染色结果(图4)OECs 纯度为85%。
徐会法等: 自组装IKVAV 多肽纳米纤维支架凝胶及其对嗅鞘细胞的作用 295Journals.im.ac.cn
图2 OECs 纯化后3 d 倒置显微镜观察(×200)Fig. 2 Inverted Microscopy observation of OECs after threeday (×200). The cells and Its slender process have very intensestereoscopic sense.图3 OECs 纯化后7d 倒置显微镜观察(×200)Fig. 3 Inverted Microscopy observation of OECs at day 7after purification (×200). The purified cells displayed thetypical spindle-shaped bi- to tripolar morphology of OECs.
图4 OECs 纯化后14d P75 NGFR DAB 染色(×100)
Fig. 4 Immunocytochemical staining of OECs withanti-NGFR P75. On the twelfth day in vitro, the cells extendedunanimously and grew in parallel directions. The purity ofOECs was determined according to immunostaining positivelyfor P75 was 85%.
3.3 IKVAV 多肽材料与OECs 的生物相容性检测复合培养7 d 和12 d 的OECs 经Calcein-AM/PI染色后, 激光共聚焦显微镜下观察发现活细胞发出绿色荧光, 死细胞发出红色荧光, IKVAV 多肽包被的盖玻片与多聚赖氨酸包被的盖玻片活细胞数所占比例均为95%以上(图5~8)。图5 OECs 与IKVAV 复合培养7 d (×100)Fig. 5 OECs cultured with IKVAV for 7 days (×100).图6 OECs6 与PLL 复合培养7 d (×100)Fig. 6 OECs cultured with PLL for 7 days (×100).
图7 OECs 与IKVAV 复合培养12 d (×100)Fig. 7 OECs cultured with IKVAV for 12 days (×100).
图8 OECs 与PLL 复合培养12 d (×100)Fig. 8 OECs cultured with PLL for 12 days (×100). The cellviabilities in Figs. 5–8 were determined by the calcein-AM/PIdouble-staining method. The Calcein-AM stained the living cellsonly (Green), while the PI stained the nucleus of the death cell(Red). At 7 or 12 days, the percentages of living cells in bothIKVAV and PLL group are more than 95%.296 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2009 Vol.25 No.2Journals.im.ac.cn\表1 各组接种OECs 3 d, 7 d 的吸光值(n=8, x ±s)Table 1 The mean value of absorbance at 3 and 7 days (n=8, mean ± S.E.M.)A Group B Group C Group D Group E Group F Group3 d 0.426±0.041 0.401±0.034 0.417±0.049 0.389±0.055 0.441±0.044 0.409±0.0587 d 0.903±0.064 0.887±0.059 0.873±0.047 0.905±0.071 0.896±0.060 0.900±0.061At 3 and 7 days, the mean value of absorbance in each of the experimental group was not significant higher than that in control group(A Group) (P>0.05).3.4 IKVAV 多肽对OECs 增殖的影响各组接种OECs 后分别于３d、７d 加入CCK-8,酶标仪测吸光度值结果如表1 所示, 各组吸光度值差异在两时间点均无统计学意义, 说明上述各浓度的IKVAV 多肽溶液对OECs 增殖无毒性作用。3.5 IKVAV 多肽对OECs 的粘附率的影响8 h、13 h 和18 h 三个时间点C 组和A 组相比P值均小于0.05, 具有显著性差异。23 h 时因为细胞黏附率都已大于60%各组均无显著性差异。图9 能很好的说明20 mg/L 的IKVAV(C 组)能有效地促进OECs 的黏附。图9 A、C、G 组各时间点OECs 的黏附曲线Fig. 9 A, C, G Group’s adhesion curve of OECs at 8、13、18、23 hours. C Group compared with A Group, IKVAV atconcentrations of 20 mg/L promoted the adhesion of OECs(P<0.05).
3 讨论
本实验中IKVAV 两亲性分子序列[6,8] 为:
C16H31O-NH-AAAGGGEIKVAV-COOH, 该序列中C16H31O 是疏水性的, 使分子聚集, 而且含有长链的烷基尾C16H31O, 该结构可提高肽对氢离子敏感度。烷基尾逐渐缩短到无烷基尾时肽对氢离子触发的自组装能力下降最终不能自组装成凝胶。序列中A3G3(-AAAGGG-)。一方面与烷基起协同效应, 另一方面使其后部的活性区域IKVAV 伸出到纤维表面, 从而暴露IKVAV 的活性区域。E 为亲水性, 使分子离散。当pH 值>9 时, 肽带负电荷, 由于静电排斥阻止其自组装, 当pH 值<8.5, 肽负电荷排斥作用消失, 疏水基团聚集。聚集的多肽分子会有规律地自组装, 形成轮辐样结构, 亲水的C 端IKVAV 活性多肽位于结构表面, N 端疏水的多肽和烷基链位于结构内部[12]。同样加入二价阳离子(如Ca2+)后, 带负电荷的肽可通过与阳离子之间的桥梁作用发生聚集,有利于自组装凝胶形成。该肽在常温下加入DMEM/F12 后, 在氢离子和二价阳离子的触发下形成疏松质软的凝胶。本实验通过AFM 观察证实该凝胶材料是编织状纳米纤维, 纤维直径为3~5 nm, 长度可达到数百纳米, 纤维之间有一定空隙, 可容纳细胞和水分子, 在结构上是一种类似于天然细胞外基质的仿生材料。本实验将OECs 种植在IKVAV 纳米自组装凝胶
基质材料上培养, 可见OECs 生长良好, 分布均匀,细胞活性良好, 活细胞占细胞总数95%以上, 同时IKVAV 多肽纳米材料对OECs 的增殖没有抑制作用,表明IKVAV 多肽具有良好的生物相容性。在粘附实验中发现IKVAV 多肽能够促进OECs的粘附, 合适浓度的IKVAV 的粘附能力强于多聚赖氨酸。现在IKVAV 材料促进OECs 黏附的具体机制尚不清楚, 可能其促进OECs 黏附的作用是IKVAV和OECs 表面表达的层粘连蛋白共同作用的结果,但是较大浓度的IKVAV-PA 可能会抑制OECs 自身层粘连蛋白的表达, 从而降低其黏附性。理想的脊髓组织工程支架材料应满足以下几个要求: 1) 良好的生物兼容性, 在体内不会引起排斥和炎症反应。2) 具有可塑性和三维立体结构, 是高度多孔的类似泡沫状, 具有很大的内表面积。有利于细胞以及相关基质分子的植入和黏附, 同时还有利于细胞营养成分的渗入和代谢产物的排出。3) 具徐会法等: 自组装IKVAV 多肽纳米纤维支架凝胶及其对嗅鞘细胞的作用 297Journals.im.ac.cn有良好的表面活性, 能促进细胞的黏附并提供良好的细胞外微环境。4) 具有生物可降解性及适宜的降解速率[10]。本实验合成的IKVAV, 具有以下特性: 1) 位于层粘连蛋白α1 链长臂的羧基末端, 是层粘连蛋白的α1 链中的核心五肽功能片段, 有很好的生物活性[11,12]; 2) 无免疫原性; 3) 生物降解性能好, 降解后的产物为氨基酸, 可作为组织修复的原料; 4) 可形成三维的更高级结构如图10 所示该肽在常温下加入DMEM／F12 后．在氢离子和二价阳离子的触发下形成疏松质软的纳米纤维支架凝胶; 5) 具有活性区域, 可作为结合细胞膜表面的配体; 6) 易获取或人工设计; 7) 触发形成凝胶条件简单, 如可为HCl, 生理盐溶液等; 8) 反应条件简单, 在常温下进行反应, 时间快, 仅需数秒钟即可完成; 9) 肽序列可根据需要进行修改; 10) 对细胞的增殖无毒副作用, 并且能促进细胞的黏附。完全合乎上述要求。近年来嗅鞘细胞被认为是最有前景在SCI 治疗取得突破的移植细胞, 因为其具有以下优点: 1) 可以诱导神经轴突的再生和中枢神经轴突的髓鞘再生
双重作用, 促进神经功能的恢复[13]; 2) OECs 移植后所创造的微环境能抑制空洞形成和瘢痕增生, 刺激感觉、运动轴突长入损伤区域, 并且作为一种具有中枢神经系统星形胶质细胞和外周神经系统雪旺氏细胞特性的独特细胞类型, 嗅鞘细胞在正常情况下也存在于中枢神经系统内, 与中枢神经的整合与在其内的迁移是自然的, 也就使得嗅鞘细胞所形成的支架桥梁—神经胶质桥, 能够穿越再生轴突无法通过的胶质瘢痕, 达到相应的靶点, 恢复损伤的神经功能[14]; 3) 在脊髓实质内迁移的能力[15]; 4) 嗅鞘细胞在其膜上表达出很多与细胞粘合和轴突生长相关的分子, 如凋控嗅神经轴突延长的Ll、PSA-N-CAM、N-CAM、laminin、fibronectin, 促进神经生长因素的分子-源自于胶质细胞的nexin 和S100。嗅鞘细胞能分泌大量不同种类的神经营养和支持因子, 如血小板源生长因子、神经肽Y、S100、神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子一3 和神经营养因子-4 等[16]为再生神经建立了很好的内环境。IKVAV 多肽纳米纤维凝胶复合的神经组织工程假体包装OECs 形成复合体后OECs 位于IKVAV 多肽纳米纤维凝胶的空隙内, 移植到损伤脊髓局部后具有以下作用: 1) 可以防止OECs 被血流冲散。2)可以提供相对稳定的内环境以利于OECs 的生长。3) 纳米纤维可以为OECs 的突起生长提供支架, 当纳米纤维分解时可以诱导OECs 的突起向远处生长。4) 合适浓度的IKVAV 能有效地促进OECs 的黏附有
利于OECs 的生长。本实验从细胞移植治疗脊髓损伤的3 个内容(种子细胞, 支架材料和各种生长因子提供的内环境)出发, 从各个方面为损伤脊髓的修复提供物质基础。纳米纤维凝胶材料IKVAV 多肽对OECs 的生物活性没有影响, 并可促进OECs 的粘附, 是一种优良的神经组织工程支架材料。OECs 与IKVAV 多肽纳米纤维凝胶复合的神经组织工程假体的形成结合了二者
的优点, 并且OECs 表面表达的分子和分泌的多种因子为神经再生提供了良好的内环境, 所以OECs与IKVAV 多肽纳米纤维凝胶复合的神经组织工程假体在脊髓损伤的治疗应用中必将有广阔的应用前景。
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