收稿日期: 2008212220 基金项目: 四川大学985项目资助
作者简介:唐成康(1976～) ,男,博士研究生,研究方向:蛋白质化学和蛋白质工程研究
3 通讯作者Corresponding author
动物源杂合肽P18对白血病K562细胞的致死作用研究
唐成康, 赵晓军
3
(四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所, 成都610041)
摘要:通过其致死白血病K562细胞过程,对动物源杂合肽P18的分子结构与功能进行了研究。MTT实验表明
P18显著致死K562细胞;Western blot实验和流式细胞分析提示P18导致K562细胞坏死,而非依赖于caspases的传
统凋亡;荧光探针标记后,观察到P18显著增加K562细胞的膜通透性;圆二(CD)图谱分析,在模拟细胞膜环境的溶
液中, P18分子出现α2螺旋。综上所述, P18肽分子可能在细胞膜微环境的介导下产生α2螺旋,产生或暴露了肽分
子的破膜结构,导致膜通透性显著增加,最终导致K562细胞的坏死。
关键词: 肽P18; 凋亡; 坏死; 质膜; 通透性; 二级结构
中图分类号:Q291; R979. 1 文献标识码:A 文章编号: 1000 - 7083 (2009) 03 - 0324 - 05
Effect of An ima l Ba sed Hybr id Peptide P18 in Human Leukem ia K562 CellDea th
TANG Cheng2kang, ZHAO Xiao2jun
3
( Institute forNanobiomedical Technology andMembrane Biology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Abstract: The structure and function of animal based hybrid pep tide P18 in human leukemia K562 cell death was stud2
ied. MTT data showed that P18 had significant anticancer activities against leukemia K562 cells. Western blot and flow cy2
tometry assay indicated that P18 caused K562 cell necrosis rather than the classical apop tosis. K562 cells treated with P18
were observed to p rofoundly enhance their p lasma membrane permeability as visualized by a florescent p robe. Circular Di2
chroic (CD) spectroscopy measurements showed that P18 adop ted anα2helix structure in membrane2mimic solution. It is
possible that P18 molecules are induced by the membrane environment and form anα2helix structure, which might endow
P18 with ability to enhance the permeability of the p lasma membrane, disrup t the cellular physiological balance and trigger
the necrosis of K562 cells.
Key words: pep tide P18; apop tosis; necrosis; p lasma membrane; permeability; second structure
长期以来,癌症的治疗是人类面临最大的医学难题之一。最新统计显示, 全世界癌症患者超过2400万,每年约有700 万患者死于癌症,约占全世界死亡人数的12. 5%。一直以来,抗癌药物的研发始终是世界关注的热点。在众多抗癌药物的研发过程中,研究者发现在某些生物,特别在动物的免疫系统中发挥重要作用的短肽分子展示出了较强的抗癌活性和较低的毒副作用( Cruciani et al. , 1991;Zasloff, 1992; Boman, 1995; Baker et al. , 1999;Hancock & Chapp le, 1999) ,抗癌短肽近年来逐渐作为潜在的抗癌药物得到重视和深入研究。其中研究者在两种源自动物的天然抗生素肽类分子天蚕素A( cecrop in A) ( Steiner et al. , 1981)和爪蟾素2 (ma2gainin2) (Zasloff, 1987)的分子序列基础上,设计出了杂合肽分子P18 ( KWKLFKKIPKFLHLAKKF) ,研究表明P18分子具有显著的抗癌活性和较低的毒副作用,是具有较高研发价值的抗癌分子( Shin et al. ,2001) ,但目前关于P18的研究没有更深入的报道。本课题探索P18分子在导致白血病K562细胞死亡中的结构与功能研究,这将有助于P18肽分子在癌症治疗中的进一步开发利用,有益于新型抗癌肽类药物的设计与开发。
1 材料与方法
1. 1 短肽P18的合成制备
委托上海波泰生物科技有限公司采用固相合成的方式合成短肽P18分子,首先通过多肽合成仪合成肽P18;然后选用HPLC色谱仪分析系统结合质谱分析确定目标肽;确定目标肽后,采用HPLC制备色谱仪进行肽P18制备;最后收集纯化的短肽溶液,通过冻干制备得到所需肽制品,最后采用质谱进行分子鉴定, 合成报告表明短肽P18 的纯度不低于95%。实验中所用P18 溶液均用无菌去离子水配制。
1. 2 细胞株及细胞培养
白血病细胞K562及胚胎成纤维细胞N IH 3T3都采用RPM I 1640培养基( Invitrogen)进行培养,该培养基中配有抗生素( 100 units/mL penicillin G,100μg/mL strep tomycin)和10%的胎牛血清。两株细胞都在37℃的含有5% CO2 的细胞培养箱中进行培养。
1. 3 MTT细胞毒性实验
向96孔板中加入含有新鲜培养基的细胞悬浊液100μL,其中K562细胞悬液浓度为5 ×104 /mL,N IH 3T3细胞悬液浓度为1 ×105 /mL。37℃孵育24h之后,每孔分别添加10 μL 不同浓度的P18肽溶液或对照溶液(无菌去离子水) ,孵育48 h。然后向每孔添加20 μL MTT反应液( 5 mg/mL MTT溶于PBS, Sigma) , 37℃孵育4 h。之后立即加入100 μL含0. 01M HCl的10%的SDS溶液,过夜,用酶标仪于570 nm处测定吸收光度值A。依据对照组来确定细胞存活率,细胞存活率=A ( P18作用组) /A (对照组) ×100%。每组实验均设置3个复孔。1. 4 Western blot检测ca spa se 3的活化由于caspase 3蛋白涉及细胞凋亡途径中的线粒体依赖途径以及死亡受体介导途径,发挥了关键的凋亡执行功能。为初步判断短肽P18对K562的致死机理是否和细胞凋亡相关,我们选择检测P18作用下, K562细胞中caspase 3蛋白的活化情况。实验中,将K562 细胞以5 ×104 /mL 的密度, 4 mL /孔
的体积接入六孔板培养, 24 h后分别加入400 μL /孔的P18肽溶液(终浓度15μM)或对照溶液(无菌去离子水,下同) ;孵育48 h后,收集细胞并提取蛋白,通过Western blot检测P18作用下K562细胞中caspase 3蛋白的活化情况。
1. 5 流式细胞技术测定
为验证短肽P18对K562的毒性和K562细胞死亡方式的初步判断,采用Vybrant Apop tosis Assay试剂盒#7 (Molecular Probes)进行流式细胞分析(其中绿色荧光染料YO2PRO21可以染早期凋亡细胞和坏死细胞,而红色荧光染料P I可以进入坏死细胞产生红色荧光) 。在六孔板上每孔接种5 ×104 /mL的K562细胞悬液4 mL。37℃孵育24 h,分别加入终浓度为20μM的P18肽溶液或对照溶液,继续孵育1h后收获K562细胞,冲洗、混悬于pH7. 4的冷PBS溶液中。YO2PRO21和P I染色30 min后,通过流式细胞仪( FACSAria, BD ) 来分析存活( YO2PRO21-P I- ) 、凋亡( YO2PRO21+ P I- )或坏死( YO2PRO21+P I+ )的K562细胞比例。1. 6 P18分子对白血病K562细胞膜通透性的影响为了确定P18对白血病K562细胞的细胞毒性,以及观测P18 对K562 细胞膜通透性的影响,采用L IVE /DEAD Viability/Cytotoxicity试剂盒中的两种荧光染料———荧光探针钙黄绿素calcein AM和溴乙非啶同源二聚体( EthD21)来开展相应实验。活细胞普遍含有细胞内酯酶,该酶可以使进入细胞的calce2in AM染料发生转化,产生非常均衡的绿色荧光;而EthD21不能进入细胞膜完整的活细胞,但可以通过已破损的胞膜进入死亡的细胞,通过与核酸的结合,在死亡的细胞中产生非常明亮的红色荧光( Pap2adopoulos et al. , 1994) 。所以我们可以通过荧光倒置显微镜来观察P18或对照溶液作用K562细胞后,细胞存活状态以及细胞膜的通透性变化。实验中,在6孔板上每孔接种5 ×104 /mL的K562细胞悬液4 mL, 37℃孵育24 h之后,分别加入终浓度为20μM的P18肽溶液或对照溶液继续孵育, 12 h后收获细胞,冲洗、混悬于pH7. 4 的PBS溶液中。经calceinAM和EthD21在室温下避光染色40 min之后,置于
倒置荧光显微镜下观察。
1. 7 P18分子的圆二( CD )图谱分析
测定和比较了P18分子在极性水溶液以及在细胞膜模拟环境中的二级结构之间的变化。实验采用了两种模拟细胞膜环境的溶液: 50% (V /V)的TFE溶液(Roccatano et a l. , 2002)和30 mM的SDS溶液(Neidigh &Andersen, 2002) 。分别将P18溶于极性水溶液和上述模拟细胞膜环境的溶液中,使P18溶液的浓度达到200μM。4℃过夜,次日在37℃条件下,采用1 m径的样品池,在190～260 nm的扫描波长范围内进行P18溶液的CD 扫描,每个样品扫描3次,采用平均数作为扫描数据结果,最后将描数据转换为摩尔椭圆率,通过比较各样品的CD图谱,分析P18分子在极性水溶液以及在细胞膜模拟环境中的二级结构之间的变化。
