tumstatin肽-由上海波泰生物科技有限公司提供合成    www.51peptide.com  　 

【摘要】  　　目的：观察tumstatin肽对体外培养的视网膜微血管内皮细胞迁移及P38MAPK蛋白表达的影响，初步探讨tumstatin肽抗视网膜内皮细胞迁移的机制。方法：采用细胞划痕实验测定tumstatin肽（T8肽）对血管内皮生长因子（VEGF）诱导下RF/6A细胞（恒河猴视网膜微血管内皮细胞）迁移的影响；Western blotting检测T8肽对VEGF刺激后15，30，45，60min的RF/6A细胞P38MAPK蛋白水平的变化。
结果：Tumstatin肽 （由上海波泰生物科技有限公司合成）对RF/6A细胞迁移具有抑制作用，且可抑制VEGF对RF/6A细胞的促迁移作用，呈剂量依赖性。正常情况下，RF/6A细胞无P38MAPK蛋白的表达，但VEGF可诱导其表达P38MAPK蛋白，而tumstatin可抑制VEGF诱导的RF/6A细胞P38MAPK蛋白的表达（加入20mg/L T8肽30，45，60min时蛋白表达受到显著抑制，差异有显著性意义，P<0.01)。结论：Tumstatin抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移，其作用可能与P38MAPK通路有关。

【关键词】  tumstatin；视网膜微血管内皮细胞；迁移；P38MAPK

　　The effect of tumstatin peptide on the migration and expression of P38MAPK protein in retinal microvascular endothelial cells

　　MinLi Huang, GuoRong Luo, WeiPing Chen, ShaoJian He, Fang Chen

　　Foundation items: Guangxi Natural Science Foundation of China (No. 0640090); Ph.D. Candidate Research Innovation Fund of Guangxi Educational Department, China (No. 2006105981001D13)

　　1Department of Ophthalmology,2 Department of Histology & Embryology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

　　Correspondence to: MinLi Huang. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China. nnhml@163.com

　　AbstractAIM: To observe the effect of tumstatin peptide on the migration and expression of P38MAPK protein in retinal microvascular endothelial cells in vitro.
METHODS: Cell scratch healing assay was used to examine tumstatins interfering effect on the migration induced by vascular endothelial growth factor (VEGF) in RF/6A cells (cell line of retinal microvascular endothelial cell of Macaca rhesus). The expression of P38MAPK protein was examined by Western blotting test at 15, 30, 45 and 60 minutes after VEGF was stimulated by tumstatin peptide.
RESULTS: Tumstatin peptide can inhibit the migration of RF/6A cells directly and can also inhibit the upregulated migration of RF/6A cells induced by VEGF. It was in dosedependent manner. There was no expression of P38MAPK protein in RF/6A cells in normal conditions, and VEGF could stimulate RF/6A cells to express P38MAPK protein, but tumstatin can inhibit the expression of P38MAPK protein induced by VEGF in RF/6A cells. CONCLUSION: Tumstatin can inhibit the migration of retinal microvascular endothelial cells. The inhibitory effect may be related to the signal path through P38MAPK. P38MAPK is not the only pathway; the knob of inhibition may  be located in the upstream of P38MAPK.

KEYWORDS: tumstatin; retinal microvascular endothelial cells; migration; P38MAPK

　　引言

    糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是较常见的致盲性眼病之一，其主要病变是视网膜新生血管形成。在新生血管形成过程中，血管内皮细胞迁移为较重要的环节之一，阻断此过程的发生能有效地抑制新生血管生成[1,2]。Tumstatin是新近发现的血管形成抑制因子，对肿瘤新生血管形成具有明显的抑制作用，且只作用于病理性的新生血管形成，而对发育和组织修复有关的新生血管形成无影响，是一种潜在的血管生成抑制剂，但其对视网膜微血管内皮细胞的作用尚未见报道[3]。本研究中，我们应用血管内皮生长因子（VEGF）诱导体外培养的视网膜微血管内皮细胞，而后应用tumstatin肽进行干预，采用细胞迁移试验和Western blotting分别检测细胞迁移和P38丝裂原激活蛋白激酶(P38MARK)蛋白表达的变化情况，试图从VEGF受体细胞信号转导通路角度初步探讨tumstatin抗视网膜内皮细胞迁移的机制。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　RF/6A细胞（恒河猴视网膜微血管内皮细胞）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。RPMI 1640培养基（美国Gibco公司），TBD胎牛血清（天津灏洋生物公司），tumstatin肽（T8肽）（氨基酸序列为H KQRFTTMPFLFCNVND VCNFASRNDYSOH，纯度高于96%，上海波泰生物科技有限公司合成），VEGF（以色列CytoLab Ltd），兔抗P38MAPK多克隆抗体（Cell signaling公司），辣根过氧化物酶（HRP)标记的人抗兔IgG（美国R&D公司），甘油醛－3－磷酸脱氢酶（GAPDH）内参抗体（Santa Cruz公司），牛血清白蛋白（BSA）（美国Sigma公司），考马斯亮蓝（上海生物工程公司），化学发光底物系统（BeyoECL）（美国Pierce 公司），蛋白质Marker（预染）（含6条带：118，86，47，34，26，19kDa）（美国MBI公司），硝酸纤维素膜（美国Millipore）。

　　1.2方法

　　1.2.1细胞迁移划痕修复实验

　　实验分为T0，T5，T10，T20组（各组培养基中T8肽的浓度分别为0，1，5，10，20，40mg/L）以及V+T0，V+T5，V+T10，V+T20组（各组中均含有0.01mg/L VEGF，T8肽的浓度分别为0，1，5，10，20，40mg/L）。每组设3个平行孔，以3×105/孔的密度接种RF/6A细胞于六孔细胞培养板，用含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液培养。待细胞生长面积达90%后，改无血清的RPMI 1640培养液使细胞饥饿24h（使细胞基本同步化，在此期间处于非代谢状态，细胞主要处于G0～G1期）。采用200μL Tip头在孔中央对细胞作一个直的宽度约为0.8mm左右的划痕。无血清培养液将刮掉的细胞冲洗干净。沿划痕边缘等距离间隔作5个标记作为数据测定点，测量时取平均值。按分组加入实验试剂，置于37℃，50mL/L二氧化碳饱和湿度的温箱中继续培养。培养0，24，48h后置10×5倍的倒置显微镜下拍照记录。用病理图像分析软件测量各个时间点的划痕两侧的细胞间距离(μm)变化，以0h划痕边沿的距离减去各个时间点迁移边沿的距离来计算各个时间段视网膜微血管内皮细胞的迁移距离，反映细胞的迁移能力（图1，迁移距离=CFDE）。

　　1.2.2 Western blotting检测P38MAPK蛋白表达

　　实验分为T0（培养基中加入PBS）、T20（培养基中加入20mg /L T8肽）、V（培养基中加入0.01mg/L VEGF）和T20+V组（培养基中加入20mg /L T8肽及0.01mg/L VEGF）。取对数生长期的RF/6A细胞，稀释成1×109个/L，接种于50mm2的培养瓶中培养，每瓶5mL。待细胞贴壁后，按分组加入不同的培养液处理细胞15，30，45，60min。吸除培养液，PBS洗涤2次，加入预冷的细胞裂解液100μL，冰浴振荡30min裂解，转移至预冷的0.5mL离心管中，于4℃，12000g离心15min。上清液转移至另一0.5mL离心管中，用考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量。分装，70℃贮存。检测各组15，30，45，60min时P38MAPK蛋白表达量。实验结果进行灰度值扫描分析，采用Bandscan5.0软件统计吸光度值。

统计学处理：实验结果以±s表示，差异显著性采用方差分析（LSD法）或配对样本的t检验，样本均数间的两两比较采用StudentNewmanKeuls法，以P<0.05作为差异有统计学意义，统计分析采用SPSS10.0统计软件完成。

　　2 结果

　　2.1 细胞迁移划痕修复实验

　　与T0组比较，V+T0组中RF/6A细胞24，48h迁移的距离较大，差异有显著性意义（P<0.01）；与T0组比较，T5，T10，T20组RF/6A细胞24，48h迁移的距离显著降低，且迁移距离随着T8肽浓度的增大而逐渐降低，各组比较差异均有显著性意义（P<0.01）；与V+T0组相比，V+T5，V+T10，V+T20组RF/6A细胞24，48h迁移的距离显著降低，且迁移距离随着T8肽浓度的增大而逐渐降低，各组比较差异均有显著性意义（P<0.01，表1)。表1 视网膜内皮细胞的迁移（略）

　　2.2 Western blotting检测P38MAPK蛋白表达

　　在T0组和T20组中均未检测到P38MAPK蛋白表达，而V组中加入VEGF刺激后，RF/6A细胞中P38MAPK被迅速激活，并持续升高，60min时蛋白表达量约为15min时的2倍（P<0.05)。与V组比较，T20+V组15min时P38MAPK蛋白表达量无显著性差异（P>0.05），而30，45，60min时蛋白表达受到显著抑制，差异有显著性意义（P<0.01)，30min时抑制率最大，为56.7%±1.7%（表2，图2）。表2 各组细胞不同时间P38MAPK蛋白表达量的对比（略）

　　3讨论

    体外新生血管形成时，启动血管生成的步骤中不仅包括内皮细胞的增殖，还包括内皮细胞的迁移。研究表明，在视网膜新生血管性疾病中，视网膜内由于缺氧等病理因素的刺激，血管形成刺激因子如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子合成增加。这些因子刺激血管内皮细胞增生，而尿激酶型纤溶酶原激活基质金属蛋白酶并使其合成增加，从而导致细胞外基质降解和内皮细胞发生迁移[46]。我们的研究结果也显示，VEGF具有促进视网膜微血管内皮细胞迁移的作用，表现在V+T0组加入VEGF刺激后RF/6A细胞24，48h迁移距离显著大于T0组。 

Tumstatin是人类IV型胶原的α3链的非胶原结构域1（NC1）功能区，是最新发现的来源于人基底膜胶原的血管形成抑制因子，具有有效的抗新生血管活性。Tumstatin主要有3个活性片段：Tum 5（指接近N端的54～132位氨基酸序列片段）、T7肽（指接近N端的74～98位氨基酸大约25个氨基酸的片段）和T8肽(指接近N端的69～95位氨基酸大约25个氨基酸的片段)，它们均具有与全长tumstatin同样的抗新生血管活性[7,8]。Hutchings等[9]研究表明，人脐静脉血管内皮细胞可以与培养皿中固定的VEGF的2种亚型VEGF165和VEGF189直接结合，这种结合受α3β1和αvβ3整合素调节，从而诱导内皮细胞的迁移和存活，而tumstatin能剂量依赖性地抑制VEGF与αvβ3整合素的结合，从而抑制内皮细胞的迁移；而抗αvβ3封闭性抗体可增强其抑制作用，提示VEGF与tumstatin竞争通过αvβ3的信号通路。在细胞迁移实验中，我们发现，加入不同浓度的T8肽后，RF/6A视网膜微内皮细胞迁移距离显著降低，说明tumstatin能抑制VEGF诱导的RF/6A细胞迁移，且成剂量依赖性。因此，我们认为，tumstatin抑制RF/6A视网膜内皮细胞迁移的作用可能也与tumstatin和VEGF竞争通过αvβ3的信号通路有关，具体机制需进一步研究阐明。

P38MAPK是由360个氨基酸组成的分子质量为38kDa的蛋白激酶，P38MAPK通路被称为应激激活的促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，主要增强细胞对应激原的抵抗力，并介导细胞凋亡的信号转导，同时调控细胞迁移，与细胞的应激、凋亡和迁移有关。多种外界信号如紫外线、渗透压、细胞因子、生理应激等均可激活P38MAPK，高血糖和糖尿病也可激活P38MAPK[10,11]。Wu 等[12]用20mg/L VEGF刺激人脐血管内皮细胞5min后，可以观察到有P38MAPK的磷酸化。我们的研究结果也显示，VEGF可以激活RF/6A细胞中的P38MAPK，表现在T0组未检测到P38MAPK蛋白表达，而V组中加入VEGF刺激后，P38MAPK蛋白被迅速激活而表达增加，与文献报道一致。我们推断VEGF诱导视网膜微血管内皮细胞的迁移是通过激活P38MAPK信号通路。Rousseau等[13]发现，在原代培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中，VEGF增强HUVEC细胞迁移，同时显著诱导以张力丝形成和纽蛋白招募到黏着斑为特征的微丝网络结构的重组；用P38MAPK特异性抑制剂SB203580抑制P38MAPK活性可抑制热休克蛋白27（HSP27）磷酸化、肌动蛋白的重构和细胞迁移，而应用ERK激酶抑制剂PD98059抑制VEGF诱导的ERK激活后，肌动蛋白结构或细胞迁移并未受影响，提示P38MAPK途径在调节内皮细胞迁移中发挥重要作用。Lamalice等[14]也证实了VEGF处理内皮细胞后触发SAPK2/P38MAPK模块的激活，从而促进弹性纤维形成和内皮细胞迁移。我们研究显示，VEGF激活RF/6A细胞中的P38MAPK后，tumstatin可以显著抑制P38MAPK蛋白的表达，表现在与V组比较，加入T8肽的T20+V组中P38MAPK蛋白的表达在各时段均有不同程度的下降。因此，我们推断，当VEGF刺激引起VEGF受体（VEGFR）的活化，进而激活P38MAPK通路时，tumstatin可通过VEGFR信号转导通路抑制P38MAPK，从而抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移。

由于T0组和T20组中均未检测到P38MAPK蛋白表达，而无VEGF存在的情况下，tumstatin也能抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移，因此我们认为tumstatin虽可能通过VEGFR信号转导通路抑制P38MAPK，进而抑制视网膜微血管内皮细胞的迁移，但P38MAPK可能并非抑制视网膜微血管内皮细胞迁移的唯一通路，或者P38MAPK也许只是抑制视网膜微血管内皮细胞迁移的下游通路，其抑制节点可能在P38MAPK的上游。

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　　8 Maeshima Y, Manfredi M, Reimer C, et al. Identification of the antiangiogenic site within vascular basement membranederived tumstatin. J 
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　　9 Hutchings H, Ortega N, Plouet J. Extracellular matrixbound vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell adhesion, migration, and survival through integrin ligation. FASEB J2003;17(11):15201522

　　10秦建华, 陈明. P38丝裂原活化蛋白激酶与细胞迁移. 泸州医学院学报 2006;29(2):166168

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