公开号 CN102030829 A
发布类型 申请
专利申请号 CN 201010534136
公开日 2011年4月27日
申请日期 2010年11月5日
优先权日 2010年11月5日
公告号 CN102030829B公开号 201010534136.2, CN 102030829 A, CN 102030829A, CN 201010534136, CN-A-102030829, CN102030829 A, CN102030829A, CN201010534136, CN201010534136.2
发明者 刘音, 单石, 孙树汉, 王越, 章意亮, 郭瀛军申请人 中国人民解放军第二军医大学导出引文 BiBTeX, EndNote, RefMan分类 (8), 法律事件 (3)
外部链接: 中国国家知识产权局, 欧洲专利数据库 (Espacenet)
一种抗黑色素瘤的ctl多表位肽及其应用
CN 102030829 A
摘要
本发明涉及医药生物学技术领域。本发明提供一种抗黑色素瘤的CTL多表位DNA疫苗，其编码基因包括3个CTL表位一个Th通用表位和5个连接子，所表达的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。这种多表位编码基因与HBc(1-75aa)和HBc(75-144aa)相经PCR方法进行连接，组成嵌合基因，再与HLA-A*0201/Kb融合基因分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A和B，构建成共表达载体，所述融合基因的诱导性表达质粒pc-HH，长度为9.3kb的环形双链。本发明所提供的抗黑色素瘤CTL多表位疫苗具有肿瘤细胞特异性、能在体内稳定表达、制备简单，制备成本低廉等特点。
权利要求(10)
1. 一种抗黑色素瘤的CTL多表位肽，其特征在于所述的多表位肽具有SEQ ID N0:5所 示的氨基酸序列：
2. 一种编码权利要求1所述的CTL多表位肽的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的编码CTL多表位肽的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列 如 SEQ ID NO ：4 所示。
4.含有权利要求3所述核苷酸序列的质粒。
5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于该质粒是pc-HH。
6.含有权利要求5所述质粒的细胞。
7.根据权利要求6所述的细胞，该细胞是大肠杆菌BL21-CP-RIL。
8.权利要求1所述的抗黑色素瘤的CTL多表位在制备预防和治疗黑色素瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的抗黑色素瘤的CTL多表位在制备预防和治疗黑色素瘤药物中 的应用，其特征在于该药物是一种嵌合表位疫苗，它的活性成份是编码HBc (l-75aa)-权利 要求1所述的CTL多表位肽-HBc (75-144aa)基因和HLA_A*0201与H_2kb基因。
10.根据权利要求9所述的抗黑色素瘤的CTL多表位在制备预防和治疗黑色素瘤药物 中的应用，其特征在于该嵌合表位疫苗的活性成份的制备包括如下步骤：A、将编码HBcAg (aal-75) ,HBcAg (aa76-144)和多表位的基因序列经PCR的方法进行连 接，形成一个HBC(l-75aa)-权利要求1所述的CTL多表位肽-HBc (75_144aa)嵌合基因；B、取200g HLA-A2转基因小鼠的脾脏组织样本，抽取总RNA，逆转录合成cDNA，再以 cDNA为模板，用PCR方法分别扩增HLA-A*0201与H_2kb基因，然后采用重叠区延伸法连接， 得到融合基因HLA-A*0201/Kb ；C、表达质粒pc-HH，所述表达质粒为长度9. 3Kb的环形双链，克隆有编码 HBC(l-75aa)-权利要求1所述的CTL多表位肽-HBc (75_144aa)嵌合基因和融合基因 HLA-A*0201/Kb的基因序列，并含有T7启动子；D、表达质粒pc-HH的构建方法，系将HBc (l-75aa)-权利要求1所述的CTL多表位 肽-HBc (75-144aa)嵌合基因和HLA_A*0201/Kb融合基因用Mlu I和Bio I双酶切，然后然 后与用Mlu I和Xho I双酶切的pIRES相连；E、工程菌 BL21 (pc-HH)，为大肠杆菌 BL21-CP-RIL。
说明
一种抗黑色素瘤的CTL多表位肽及其应用技术领域[0001] 本发明涉及医药生物学技术领域，具体涉及用基因工程方法制备抗黑色素瘤的 CTL多表位肽及其疫苗。背景技术[0002] 黑色素瘤是一种源于皮肤、粘膜、眼和中枢神经系统色素沉着区域的黑素细胞的 恶性肿瘤。该肿瘤转移发生早，扩散迅速，往往在医生作出诊断之前，癌细胞已经扩散全身。 一旦被评估为恶性肿瘤后，可在诊断数月后死亡，是目前已知死亡率最高的一种皮肤癌。传 统上以手术切除为主要治疗方法，其手术效果与肿瘤的组织学类型、病变侵袭深度及有无 淋巴结转移等直接相关。由于患者多数发现较晚，故一般认为术后五年生存率仅在20%～ 30%之间。因为基底细胞癌对放射治疗敏感，如癌体离脸缘较远和累及范围较小者，可以单 独应用放射治疗。但是放射治疗也可能会带来一些并发症，如放射性皮炎、角膜炎及白内障寸。[0003] 分子靶向药物和化疗联合应用是目前提高黑色素瘤术后生存率最有前景的治疗 方法。肿瘤疫苗属于新型分子靶向药物的一种，它是用肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物或肿瘤抗 原刺激机体免疫系统产生特异性抗肿瘤细胞免疫效应，是一种新型的肿瘤治疗方法，也是 一种主动性免疫疗法。黑色素瘤细胞大多数具有特异性抗原，针对这些抗原可以设计多种 类型疫苗。[0004] 人黑色素瘤抗原MAGE-I (AAN62752)和MAGE-3 (AAA 17446)是一种CT抗原，在多种 肿瘤组织中分布，而在正常组织中除了封闭性的组织如睾丸和卵巢之外没有表达。因此是 一类理想的可用于主动免疫治疗的肿瘤抗原。MAGE-3蛋白的表位肽以及用这些肽刺激的 树突状已经被应用于肿瘤动物模型和临床前期研究，并且已经取得了一定的疗效。但其缺 点也十分明显，如制备的代价、刺激免疫反应的强度和机体个体间的MHC限制性差异等，都 是肽疫苗的应用所必须面临的问题（宋淑霞，刘贵然等，人黑色素瘤抗原MAGE-3肿瘤疫苗 的构建及其诱导HLA-A*0201转基因小鼠CTL活性的观察，肿瘤防治研究2007年第34卷第 10 期:739-742)。[0005] 抗肿瘤的核酸疫苗作为近几年新兴的一种疫苗，与其他种类疫苗相比有其独特的 优点：1.抗原合成与递呈过程与病原的自然感染相似，核酸疫苗在机体内所表达的蛋白将 以天然蛋白形式出现；2.免疫原单一，只有编码所需抗原基因导入细胞得到表达，载体本 身没有抗原性；3.能在体内持续表达，持续刺激免疫系统；4.易操作性和稳定性，可以方便 地制备出多价核酸疫苗；5.当在质粒中整合入CKs (cytokines)或共刺激分子基因，或与编 码这一成分的质粒共注射时，将能加强随后机体对编码抗原的反应，或可调节正在起作用 的免疫反应。[0006] HLA-A2. 1/Kb转基因小鼠表达人的HLA_A*0201分子，是研究HLA-A2. 1限制性T细 胞反应及评价HLA-A2. 1限制性表位疫苗的重要模型。这种嵌合型转基因小鼠已被用于更 精确地筛选来自乙型肝炎、丙型肝炎及人乳头瘤病毒的一系列HLA-A2. 1限制性表位。本研究将HLA-A0201基因及携带多表位的HBc基因片段同时转染小鼠B16肿瘤细胞，该细胞可 以在C57BL小鼠体内生长而不会被排斥，这样即可通过体内实验来研究疫苗的评价效果及 免疫机制。发明内容[0007] 本发明的目的在于提供一种抗黑色素瘤的CTL多表位肽及其在制备核酸疫苗中 的应用。[0008] 本发明针对目前抗黑色素瘤肽疫苗成本昂贵、制备困难、刺激免疫强度大等缺陷， 将来自MAGE-1，MAGE-3两个不同抗原的三个限制性表位以串联方式构建一种兼具简易制 备、稳定表达和高特异性的多表位多肽，以及含有该表位多肽的肿瘤核酸疫苗，以达到预防 和治疗黑色素瘤的目的。[0009] 因此，本发明的首要方面是一种重组多表位黑色素瘤细胞疫苗。该疫苗包括一种 重组蛋白，所述重组蛋白包括与HLA-A*0201限制性的⑶8+ T淋巴细胞的多个候选表位对 应的表位肽。[0010] 本发明的第二方面是一种HCC多表位序列及其表达质粒pc-HE，它包括编码来自 MAGE-I和MAGE-3抗原的多个HLA-A2限制的表位的HBC (l_75aa)-多表位-HBc (75_144aa) 嵌合基因序列，克隆到真核表达质粒pcDNA3. lV5-His B。该表达质粒为长度6. 11Λ的环形 双链。[0011] 本发明的第三方面是一种可用大规模制备的共表达质粒pc-HH。所述表达质 粒为长度9. 3kb的环形双链，克隆有HBc (l-75aa)-多表位-HBc (75-144aa)嵌合基因和 HLA-A*0201/Kb融合基因序列。[0012] 本发明的表达质粒pc-HE的构建，系将HBc (l-75aa)_多表位-HBc (75_144aa)嵌 合基因用Hind III和Xho I双酶切，然后与用Hind III和Xho I双酶切的pcDNA3. 1-V5/ HisB相连。[0013] 本发明的表达质粒pc-HH的构建，系将HBc (l-75aa)_多表位-HBc (75_144aa)嵌 合基因和HLA-A*0201/Kb融合基因用Mlu I和Bio I双酶切，然后然后与用Mlu I和Bio I 双酶切的PlRES相连。[0014] HBC (l-75aa)-多表位-HBc (75_144aa)嵌合基因的制备方法，其特征在于包括如 下步骤：[0015] 将编码HBcAg (aal-75)、HBcAg (aa76_144)和多表位的基因序列经PCR的方法进行 连接，形成一个HBC(l-75aa)_多表位-HBc(75-144aa)嵌合基因。取200g HLA-A2转基因 小鼠的脾脏组织样本，抽取总RNA，逆转录合成cDNA。再以cDNA为模板，用PCR方法分别扩 增HLA-A*0201与H-2kb基因。然后采用重叠区延伸法连接，得到融合基因HLA_A*0201/Kb。[0016] 表达质粒pc-HH，所述表达质粒为长度9. 3Kb的环形双链，克隆有编码 HBC(l-75aa)-多表位-HBc (75-144aa)嵌合基因和融合基因HLA_A*0201/Kb的基因序列，并 含有T7启动子。[0017] 表达质粒PC-HH的构建方法，系将HBc (l-75aa)-多表位-HBc (75-144aa)嵌合基 因和HLA-A*0201/Kb融合基因用Mlu I和Xho I双酶切，然后然后与用Mlu I和Xho I双 酶切的PlRES相连。[0018]工程菌 BL21 (pc-HH)，为大肠杆菌 BL21-CP-RIL。[0019] 本发明构建的HBc-多表位基因和HLA_A*0201/Kb融合基因的共表达质粒能共表 达HBc-多表位基因与HLA-A*0201/Kb融合基因，表达产物能保留各自的生物学活性，从而 得到一种具有CTL多个抗原表位并能对其抗原递呈功能方便鉴定的HCC多表位疫苗。[0020] 本发明构建的真核表达载体pc-HH可稳定转染黑色素瘤B16细胞，分别用RT-PCR、 western blot、细胞流式检测重组表达载体稳定转染细胞中目的抗原的表达情况，pc-HH重 组子稳定转染的细胞株可见目的蛋白的表达，而对照空表达载体稳定转染的细胞株未见目 的蛋白的表达，说明检测到的信号是特异的。附图说明[0021] 图1 ：重叠延伸PCR法构建质粒pc-HE示意图[0022] 其中图A为多表位核酸疫苗的构建与鉴定。第M列是核酸分子量marker，第1列是 PCR扩增的HBc (aal-75)序列，第2列是PCR扩增的多表位基因，第3列是HBc (aal-75)和 多表位基因连接产物，第4列是PCR扩增的HBc (aa76-144)序列，第5列是HBc (aal-75)-多 表位基因-HBc (aa76-144)的全场序列；图B为携带有多表位序列的HbcAg基因克隆插入 pcDNA3. 1/V5-His B 表达质粒。[0023] 图2 ：重叠延伸PCR法构建质粒pc-HH电泳图[0024] 其中图A是HLA/H_2kb的PCR产物在1. 0%琼脂糖凝胶中的核酸电泳图。第1列是 经PCR扩增的HLA_A*0201 α 1, α 2结构域，第2列是PCR扩增的α 3和H_2kb胞浆功能区， 第3列是HLA-A*0201/H-2kb嵌合基因；图B是pc-HH的电泳鉴定。第1列是XhoI和MluI 酶切消化的pIRES—HLA/H-2kb，第2列是Mc I和Xba I酶切消化的pIRES—HLA/H-2kb，M 列是核酸分子量marker。图C是HLA-A*0201/H_2kb嵌合基因和HBc/multi印itope的克隆 图。[0025] 图3 ：候选肽的HLA_A*0201亲和力分析[0026] 用10mg/ml的DMSO溶解合成肽，并用PBS稀释至终浓度lmg/ml。在T2 cells (1 X 106/200 μ 1)中以10 μ g/ml的量加入合成肽，并在37°C孵育2小时。细胞被FITC 染色标记抗HLA-A2. 1单克隆抗体（BB7. 2)。FACScan为荧光亮度参照。[0027] 图4 :pc-HH重组子稳定转染细胞中目的抗原的表达[0028]其中图 A 是 RT-PCR 检测 HLA-A*0201/H_2kb 在 HBc/multi印itope 细胞中的表达。 第1列是HLA-A*0201/H-2kb在pIRES表达质粒中转染B16细胞后的扩增表达，第2列是 HLA-A*0201/H-2kb在pc_HH中转染B16细胞后的扩增表达，第3列是HBc/multi印itope在 PIRES中转染B16细胞后的扩增表达，第4列是HBc/multi印itope在pc_HH中转染B16细 胞后的扩增表达；图B是western blot检测pc_HH转染B16细胞后HBc/multi印itope蛋 白的表达。第1列是PlRES转染B16细胞，第2列是pc-HH转染B16细胞；图C是FASC检 测分析pc-HH转染B16细胞后HBc/multi印itope蛋白的表达。[0029] 图5 ：免疫小鼠脾细胞对B16-pC-HH黑色素瘤细胞的特异性CTL活性测定将6 只A2转基因小鼠的脾脏淋巴细胞，使用电穿孔的方式加入对照质粒并分别加入AFP542， MAGE-I278,MAGE-3271三种多表位肽和OVA257体外刺激培养7天。被注入空质粒或PBS的免疫 小鼠，以及用OVA257刺激的脾细胞相对于三种多表位没能诱导产生足够明显反应。用pc-HE接种疫苗和单独使用三种多表位肽其中的一种，只能检测到低水平的CTL反应。[0030] 图6 =ELIspot检测分泌IFN- γ的CD8+T细胞数[0031] 其中图A是7天免疫后小鼠，分别经过HLA2. 1/Kb和HBc/ multiepitope(B16-pc-HH)或者野生B16黑色素瘤细胞刺激后，ELISPOT检测；图B是7天 免疫后小鼠脾细胞分别经AFP542，MAGE-I278，MAGE_3271，OVA257或空白对照体外刺激48小时 后，ELISPOT检测。[0032] 图7 ：免疫小鼠对B16-HLA-MAGE-3移植肿瘤的生长抑制作用[0033] 将空质粒和PBS注射到老鼠体内当做阴性对照。在每只七天持续免疫小鼠身体左 侧接种IO6 B16-PC-HH细胞。肿瘤生长描述P<0.01，在分别接种14天，17天，20天后，相 比PBS对照组肿瘤生长差异开始有统计学意义。其中图A中每个点代表六只小鼠接种不同 天数后肿瘤大小的平均数。图B点代表每组小鼠接种25天后的单体肿瘤大小。具体实施方式[0034] 下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的保护范围。[0035] 本发明中所用的菌株和基因工程载体为大肠杆菌DH5 α、ToplO ；pcDNA3. lV5_His B载体（购自Invitrogen Life Science) ；pIRES载体（购自Clontech)。所用肿瘤细胞 株为表达HLA-A*0201分子的人TAP-缺陷型细胞株T2，起源于C57BL小鼠的B16 (H_2b)，两 种细胞株均购自ATCC (Manassas，VA, USA)。CTL多表位DNA疫苗的编码基因序列委托上海 捷倍思公司进行全基因合成。抗原多肽由上海波泰生物技术有限公司采用标准的F-moc固 相法合成，多肽的纯化采用逆相HPLC，多肽纯度> 95%。所用转基因小鼠为6～8周雄性 HLA-A*0201/kb 转基因小鼠，购自 Jackson 实验室（Bar Harbor, ME, USA)，表达人的 MHC I 类分子的α?和0 2功能区和小鼠!1-2妒的α 3功能区。由中国人民解放军第二军医大学 实验动物中心按清洁级动物培养法培养。[0036] 实施例1 :CTL多表位肽的设计和构建[0037] 所购建的CTL多表位肽共包括3个CTL表位、一个Th通用表位和5个连接子。3 个表位均为在HCC上高表达的MHC I类分子限制的CTL表位，分别是：[0038] MAGE-3(271_279)FLffGPRALV (SEQ ID NO ：1),[0039] AFP(542_550)GVALQTMKL (SEQ ID NO ：2)[0040] MAGE-I(278_286)KVLEYVIKV (SEQ ID NO :3)。[0041] 然后根据计算机辅助设计优化确定各表位、接头序列以串珠状聚合排列序列，原 则保障是各表位之间用合适的接头序列间隔以维持各表位的空间构象不相互干扰。[0042] 最后确定的CTL多表位肽的氨基酸序列，5’到3’的顺序是：[0043] GAA-FLffGPRALV-NAAA-KVLEYVIKV-KAA-PADRE-GAAA[0044] GVALQTMKL-GAA[0045]其中 FLWGPRALV、KVLEYVIKV、GVALQTMKL 为三个不同的 CTL 表位；GA、KAA、GAAA, NAAA为Linker ；Th表位PADRE由13个氨基酸组成的通用T表位（AKFVAAWTLKAAA)。[0046] 根据以上步骤选择的最佳排列顺序，确定相应的偏爱密码子组成的编码基因序列 如下，委托上海捷倍思公司进行全基因合成。[0047] GGCGCGGCGTTTCTGTGGGGCCCGCGCGCGCTGGTGAACGCGGCGGCGAAAGTGCT[0048] GGAATATGTGATTAAAGTGAAAGCGGCGGCCAAGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAA[0049] GGCTGCCGCTGGCGCGGCGGCGGGCGTGGCGCTGCAGACCATGAAACTGGGCGCGG[0050] CG (SEQ ID NO ：4)[0051 ] 实施例2 ：候选肽的HLA_A*0201亲和力分析[0052]分别合成 MAGE-3 (271_279) FLffGPRALV，AFP (542_550) GVALQTMKL 和 MAGE-1 (278_286) KVLEYVIKV 3个表位多肽，应用免疫荧光法检测多肽与HLA-A*0201分子的结合情况。以荧光系数（FI) 作为亲和力的检测指标，发现多肽HCC的三个抗原表位肽与HLA-A*0201分子均具有较高亲 和力，见图3。[0053] 实施例3 =HBc (l-75aa)-多表位-HBc (75-144aa)嵌合基因序列的获得[0054] 首先分别以全基因合成的本发明的表位多肽的DNA序列和HBV(adr亚型）基 因组DNA为模板，用下表给出的引物分别扩增多表位及HBc(l-75aa) (SEQ ID NO ：6)和 HBc(75-144aa) (SEQ ID NO :7)的基因片断，然后将这3个片断经PCR的方法进行连接，形 成一个HBC (l-75aa)-多表位-HBc (75-144aa)嵌合基因。具体步骤如下：[0055] (1)用引物P5和引物P6扩增多表位序列的全部编码基因。其中引物P5为：5' -C GGGGCGCCTTTATGAACAAATTTATTTATG-3‘，该引物与多表位编码序列的5'端一致，同时引入 Bbe I 限制性内切酶位点。引物 P6:5' -GCGGAGCTCCGCCGCGCCCACCAG-3 ’，引入 Sac I 限 制性内切酶位点。采用高保真Pfu DNA聚合酶进行PCR反应，其中dNTP浓度为20 μ Μ,Mg2+ 浓度为1. 5mM，变性、退火、延伸的温度分别为94°C、55°C、72°C，时间分别为45秒、4秒和1 分钟，共进行30个循环。[0056] (2)用引物P7和P8扩增HBcAg(aal_75)的编码序列片段。引物P7为： 5' -GCTCTAGAATG GAC ATT GAC CCG TAT AAA GAAT-3‘，该引物引入 Xba I 限制性内切酶 位点。引物 P8 为：5 ‘ CGGGGCGCCATTACTTCCCACCCAGGTGG-3 ‘，该引物引入 Bbe I 限制性内 切酶位点。PCR反应程序同（1)，共进行30个循环。[0057] (3)用引物P9和PlO扩增HBcAg(aa76_144)的编码序列片段。引物P9为：5' -G CGGAGCTCGGTGCCGCGTTGGAAGACCCAGC-3‘，该引物引入Sac I限制性内切酶位点。引物PlO 为：5' ACGCGTCGACTCAGGCACCCGGAAGTGTTGATAAG-3'，该引物引入 Sac II 限制性内切酶位 点。PCR反应程序同（1)，共进行30个循环。[0058] (3)利用Me I, Xba I、Bbe I对上述PCR产物进行双酶切，反应采用高盐（H)缓 冲体系，37°C酶切3小时。然后经1.0%琼脂糖电泳分离后，作凝胶回收。酶切片段和载体 按照5 ： 1的摩尔比混合，加入相应的连接缓冲溶液和T4连接酶，16°C连接12小时，即可 得到HBc (l-75aa)-多表位-HBc (75_144aa)嵌合基因。Primer sequencesName sequences(sence/antisence primer)Multiepitope P5:5' CGGGGCGCC TTTATGAACAAATTTATTTATG-3' Bbe IP6: 5'-GCGGAGCTCCGCCGCGCCCACCAG-3' Sac I [0059] HBcAg(aal-75) P7: 5’-GCTCTAGAATGGACATT GACCCG TAT AAA GAAT 3'Xba IP8: 5，-CGGGGCGCCATTACTTCCCACCCAGGTGG -3' Bbe I HBcAg(aa76-144) P9:5-GCGGAGCTCGGTGCCGCGTTGGAAGACCCAGC Sac IP10: 3'-ACGCGTCGACTCAGGCACCCGGAAGTGTTGATAAG Sal I[0060] 实施例4 ：表达质粒pc-HE的构建[0061] 利用引物P5和PlO对上述方法扩增得到的HBc (l-75aa)-多表位-HBc (75-144aa) 嵌合基因进行测序，测序反应由上海基康公司完成。经测序正确后，用Hindlll、XbaI双酶 切，与用Hindlll、XbaI双酶切的载体pcDNA3. lV5_His B连接。酶切和连接反应的限制性 内切酶和T4连接酶均购自TaKaRa公司，反应采用酶说明书所推荐的体系进行。本发明所 利用的表达载体pcDNA3. lV5-His B全长5. 5Kb (千碱基对），含有噬菌体T7启动子、质粒复 制起点（ori)和氨苄抗性基因（Amp)。具体反应过程如下：[0062] 利用HindIIlJbaI对上述PCR产物及载体进行双酶切，反应采用高盐（H)缓冲体 系，37°C酶切3小时。然后经1.0%琼脂糖电泳分离后，作凝胶回收。酶切片段和载体按照 5 ： 1的摩尔比混合，加入相应的连接缓冲溶液和T4连接酶，16°C连接12小时。[0063] 实施例5 :HLA-A*0201/Kb嵌合基因的制备[0064] 取200g HLA-A2转基因小鼠的脾脏组织样本，抽取总RNA，逆转录合成cDNA。再以 cDNA 为模板，用 PCR 方法分别扩增 HLA-A*0201 (SEQ ID NO ：8)与 H_2kb 基因(SEQ ID NO ： 9)。然后采用重叠区延伸法连接，得到融合基因HLA-A*0201/Kb。具体步骤如下：[0065] (1)用引物Pl和引物P2扩增HLA_A*0201基因的全部编码基因。其中引物Pl为： 5' -CCGCTCGAG ATGGCCGTCATGGCGCCCCG-3 ‘，该引物与 HLA_A*0201 编码序列的 5 ‘端一 致，同时引入XhoI限制性内切酶位点。引物B ：5' -TCATGCACCATGCACTCTTGTCCTCCGCTACTGC CACCTGCAGGGCCGATGAGTTTCAAGCA-3 ‘。采用高保真 pfu DNA 聚合酶进行 PCR 反应，其中 dNTP 浓度为20 μ M，Mg2+浓度为1. 5mM,变性、退火、延伸的温度分别为94°C、55°C、72°C，时间分别 为45秒、4秒和1分钟，共进行30个循环。[0066] (2)用弓丨物P3和P4扩增H_2kb的编码序列片段。引物P3为： 5 ‘ -GGCGCCATTCCCCAAAGGCCCATG-3 ‘。引物 P4 为：5 ‘ -CGACGCGTCTGTCTTCACGCTAGAGAATG -3'，该引物引入Mlu I限制性内切酶位点。PCR反应程序同（1)，共进行30个循环。[0067] (3)利用重叠区延伸法获得编码HLA_A*0201和H_2kb的融合基因。上述两步PCR反 应得到的产物分别利用1.0%琼脂糖电泳分离，然后作凝胶回收。回收后的产物94°C变性5 分钟，将两次PCR的产物混合后于50°C退火。因为引物B和C具有重叠的部分，因而退火后 可以使HLA-A*0201基因的单链和H-2kb的单链配对。添加DNA聚合酶、MgCl2、10XPCR缓冲 液、dNTP后，进行PCR扩增。利用这种方法，使两个基因连接成一个融合基因HLA-A*0201/ Kb。为保证高保真的扩增，整个PCR程序均采用TaKaRa公司的pfu DNA聚合酶，50 μ 1反应 体系，变性、退火、延伸的温度分别为94°C、50°C、72°C，时间分别为45秒、45秒和1分钟，共 进行20个循环（具体方法参见《靶向新基因的分子克隆策略一理论与方法》，军事医学科学出版社，1999出版）。[0068] 实施例6 ：表达质粒pc-HH的构建[0069] 利用引物P3和P4对上述方法扩增得到的HLA_A*0201/Kb融合基因进行测序，测 序反应由上海基康公司完成。经测序正确后，用)(hoI、Mlu I双酶切，与用)(hoI、Mlu I双酶 切的载体PlRES连接。酶切和连接反应的限制性内切酶和T4连接酶均购自TaKaRa公司， 反应采用酶说明书所推荐的体系进行。本发明所利用的表达载体PlRES全长6. 1Kb (千碱 基对），含有菌体T7启动子、质粒复制起点（ori)和氨苄抗性基因（Amp)。具体反应过程如 下：[0070] 利用B10I、Mlu I对上述PCR产物及载体进行双酶切，反应采用高盐（H)缓冲体 系，37°C酶切3小时。然后经1.0%琼脂糖电泳分离后，作凝胶回收。酶切片段和载体按照 5 ： 1的摩尔比混合，加入相应的连接缓冲溶液和T4连接酶，16°C连接12小时。[0071] 实施例7:工程菌的制备[0072] 将上述连接后的产物转化大肠杆菌菌株BL21-CP-RIL，得到工程菌BL21 (pc-HH)。 具体步骤为：先将宿主菌BL21-CP-RIL于50ml LB培养基（含1 %的胰蛋白腺，0. 5 %酵母 提取物和氯化钠，ρΗ7? 0)中，37 °C振荡培养至OD600为0. 4时，在4 °C下，以4000rpm的 转速离心，收集宿主菌；去除上清液后，用l_2ml冰预冷的lOOmmol/L的氯化钙溶液重悬， 即得感受态细菌。将IOOng上述构建的质粒与感受态细菌于冰浴中冷却30分钟，42°C热休 克90秒，然后再于冰浴中冷却10分钟。加入0. 8ml的LB，于37°C培养1小时后，取0. 2ml 转化产物涂布于含有相应抗生素的LB琼脂平板上，37°C培养12-15小时后，即获得单克隆 的含有重组质粒的宿主菌。抽提宿主菌质粒，用Ndel、XhoI双酶切能够切出一条2. 3Kb的 条带，该宿主菌即为阳性重组子。含有质粒pc-HH的大肠杆菌菌株BL21-CP-RIL为工程菌 BL2I-CP-RIL(pc-HH)[0073] 实施例8 ：真核表达载体pc-HH稳定转染黑色素瘤B16细胞及目的抗原的表达[0074] 将B16黑色素瘤细胞培养在含10% NCS的DMEM培养基的6孔板中，当细胞密度达 90%，换成无抗生素、无血清的DMEM，继续培养2～4h。然后，用脂质体lipof ectamin2000 的方法（INVIT0RGEN公司）将共表达质粒pc_HH转染到B16黑色素瘤细胞中。转染后Mi 换成完全培养基，24h后用终浓度1000mg/ml的G418筛选，并每隔4?换液一次，一般7～ IOd出现阳性克隆。当阳性克隆长到1/4视野，在显微镜下将阳性细胞转移到96孔板，继续 在含G418的培养液中培养，当细胞数增加到一定程度后，将细胞转移到6孔板。待细胞长 满孔后，收集细胞抽提总RNA和总蛋白，用RT-PCR和Wfestern blot分析HLA-A*0201/H_2kb 嵌合基因及HBc/多表位基因片段的表达。同时，MTT法比较未转染、转染空载体及转染共 表达载体pc-HH的B16细胞的增殖能力。[0075] 分别用RT-PCR、western blot、细胞流式检测重组表达载体稳定转染细胞中目的 抗原的表达情况，结果见图4。pc-HH重组子稳定转染的细胞株可见目的蛋白的表达，而对 照空表达载体稳定转染的细胞株未见目的蛋白的表达，说明检测到的信号是特异的。[0076] 实施例9 ：小鼠分组及免疫方法[0077] 将雄性HLA-A2转基因小鼠分为3组。在第0和第21d分别采用电穿孔法（BTX ECM830)给第1组小鼠肌肉注射pcDNA3. l_V5/His B空质粒(100 μ g/100 μ 1/鼠)；给第2 和第3组小鼠注射相同的但表达HBc-多表位的重组表达质粒。电穿孔的参数如下=Voltage100L(Mode :Low voltage) ；Pulse Length 50ms ；Pulses 5 ；Interval lpulse/s.在第 2 次 免疫后的14d，给第2组的小鼠皮下注射4种CTL抗原表位肽的混合物（50yg/mOUSe)；给 第3组小鼠皮下注射4种CTL抗原表位肽的混合物（50 μ g/mouse)及HBV核心抗原肽（HBV Core 128-140 ρ印tide (TPPAYRPPNAPIL，140 μ g/mouse))。肽的总体积为 50 μ 1，注射时加 入等量体积的福氏完全佐剂（IFA)，注射部位为背部颈部皮下，注射空质粒组用PBS攻击。[0078] 实施例10 ：免疫小鼠脾细胞对B16-pC-HH黑色素瘤细胞的特异性CTL活性测定[0079] 取免疫小鼠脾脏淋巴细胞O XlO6Ail)，分别加入三种抗原表位肽，同时加入终浓 度为lOng/ml的IL-2，培养7天后，收集效应细胞，进行特异性杀伤活性分析。[0080] 靶细胞选为负载表位多肽的T2、SW480细胞及未加负载的T2和SW480细胞，以及 稳定转染、表达目的抗原的pc-HH和野生型B16细胞。[0081] 效应细胞对靶细胞的杀伤活性的检测采用4小时LDH释放实验。分别用负载的T2、 SW480细胞及未加负载的T2、SW480细胞或表达目的抗原的黑色素瘤细胞pc_HH作、野生型 B16为靶细胞。将刺激后的脾脏T淋巴细胞和靶细胞按不同的比例（100 ： 1,50 ： 1、25 ： 1 及12.5 ： 1)加入到96孔培养板中，效靶细胞各100μ1，均设3复孔，同时设靶细胞最大释 放量（100 μ 1靶细胞+100 μ 12% TritonX-100)、自发释放量（100 μ 1靶细胞+100 μ 1无酚 红培养基)、自然背底Ο00 μ 1无酚红培养基)、效应细胞（100 μ 1效应细胞+100 μ 1无酚红 培养基）释放量。250g离心5min，于37°C含饱和水气、5%的C02的培养箱中培养4h，250g 离心5min，吸取100 μ 1上清至另一 96孔板中，加入检测LDH含量的反应液，18°C～25°C避 光反应30min，测492nm波长的吸光值，按下面的公式计算CTL对靶细胞的杀伤活性：[0082]实验组释放量一自发释放量 -χ 100%最大释放量一自发释放量[0083] 实验结果可见，免疫小鼠脾细胞在体外用肿瘤抗原或抗原肽刺激后，可有效杀伤 B16-pc-HH黑色素瘤细胞，在效靶比例为100 ： 1时，杀伤率高达47% ；而对B16_pIRES肿 瘤细胞的杀伤率只有8 %，二者有显著性差异，见图5。[0084] 实施例10 =ELIspot检测分泌IFN- γ的CD8+T细胞数[0085] 为了进一步明确B16-pC-HH黑色素瘤细胞株可以递呈3种抗原表位，并能被抗原 特异性CD+T细胞识别，用ELISpot的方法检测用该细胞与免疫小鼠脾脏淋巴细胞共孵育 后，⑶8+Τ细胞被活化的情况。[0086] 向ELISpot板的每孔中加入50 μ 1抗小鼠IFN- γ的单克隆抗体和50 μ 1 PBS,封 好板于4°C包被过夜，倾掉包被液，用PBST洗10次；向孔中加入封阻液（包含1 % BSA的 PBS)200y 1，4°C封闭过夜。倾倒液体（不洗孔）。向孔中加入IXlO5效应细胞与IXlO5 刺激细胞，盖上板盖，于37°C 5% C02的细胞培养箱中孵育16h ；用力倾倒孔中的液体，加入 200 μ 1冰冷的去离子水，冰上放置lOmin，用PBST洗板10次；加入100 μ 1生物素化的检测 抗体，37°C放置Ih或4°C过夜；然后倾倒板中的液体，PBST洗10次；加入50μ1φ标记的抗 生物素的抗体（GABA)，37°C孵育lh，X 100%去除孔中的液体，用PBST洗10次，把孔中的液 体在草纸上拍干；最后向孔中加入30 μ 1 activator溶液，室温放在暗处孵育15～30min， 在光镜下观察点的形成情况，一旦点形成后，及时用无菌去离子水终止反应。[0087] 在用3种抗原肽再次刺激免疫小鼠脾脏淋巴细胞后，可检测到分泌IFN-Y的 CD8+T细胞，表明在免疫小鼠脾脏中存在抗原特异性的CD8+T细胞。进一步用表达目的抗原 的B16-pC-HH黑色素瘤细胞刺激免疫小鼠脾脏淋巴细胞，也观察到分泌IFN- γ的⑶8+Τ细 胞，而且与抗原肽刺激的程度相当。见图6。[0088] 实施例11 ：免疫小鼠对B16-HLA-MAGE-3移植肿瘤的生长抑制作用[0089] 将体外培养至对数生长期的B16-pC-HH和B16_pIRES分别移植到免疫过的HLA转 基因小鼠（106/只）。肿瘤移植后的第5d，阴性对照组可触及到肿瘤块生长。从荷瘤的第 5d，每天用游标卡尺测量瘤块大小，按公式（长径X短径2)/2计算肿瘤块的体积（mm3)，得 到肿瘤生长曲线图（图7A)。从图可见，B16-pC-HH移植小鼠，从荷瘤第10d，除实验组有 一只小鼠肿瘤停止生长外，实验组小鼠肿瘤生长明显缓慢，与阴性对照组比有显著性差异 (均为P <0.01)；在小鼠荷瘤的第25d，将小鼠全部处死，测量肿瘤大小（图7B)，可知实验 组的6只小鼠肿瘤块均小于对照组。[0090] 统计方法均采用Student，s t test。
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